Cách xác định hàm lượng Glucose, Fructose trong thực phẩm

Chào các bạn,

Hàm lượng glucose, fructose có trong các loại nước quả được xác định bằng phương pháp gì? Cùng theo dõi bài viết dưới đây của SMI FOOD nhé!

Theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10693:2015 (EN 1140:1994) về Nước rau, quả thì hàm lượng D-glucose, D-fructose được xác định bằng phương pháp sử dụng enzym và đo phổ NADPH.

Nguyên tắc phương pháp

D-glucose và D-fructose có trong mẫu thử pha loãng được phosphorin hóa tại vị trí cacbon số 6 (C-6) trong phản ứng xúc tác enzym bao gồm ATP và HK.

Trong phản ứng trùng hợp, glucose 6-phosphat được chuyển thành 6-phosphogluconat khi có mặt NADP, phản ứng được xúc tác bởi enzym G-6-P-DH và một lượng NADPH tương đương với lượng D-glucose được tạo thành có mặt trong mẫu thử.

Hàm lượng D-fructose có thể xác định được bằng cách cho phản ứng tiếp trong đó PGI xúc tác đồng phân hóa F-6-P thành G-6-P.

Định lượng NAPDH tạo thành và hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose bằng đo phổ.

Phản ứng trong phép xác định D-glucose

D-glucose + ATP G-6-P + ADP

G-6-P + NADP⁺ 6-phosphogluconat + NADPH + H⁺

Phản ứng trong phép xác định D-fructose

D-fructose + ATP F-6-P + ADP

F-6-P G-6-P

G-6-P + NADP⁺ 6-phosphogluconat + NADPH + H⁺

Thuốc thử

Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

Dung dịch đệm triethanolamin, pH = 7,6

Hòa tan 14,0 g triethanolamin clohydric và 0,25 g magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O) trong 80 ml nước, điều chỉnh đến pH 7,6 dùng khoảng 5 ml dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 5 mol/l và thêm nước đến 100 ml. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch này bền được ít nhất 4 tuần.

Dung dịch NADP

Hòa tan 60 mg muối dinatri β-Nicotinamid-adeninedinucletoid phosphat (β-NADP-Na₂) trong 6 ml nước. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch này bền được ít nhất 4 tuần.

Dung dịch ATP

Hòa tan 300 mg muối dinatri adenosin-5′-triphosphat ngậm ba phân tử nước (ATP-Na₂H₂.3H₂O) và 300 mg natri hydro cacbonat (NaHCO₃) trong 6 ml nước. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch này bền được ít nhất 4 tuần.

Huyền phù enzym HK/G6P- DH

Tạo huyền phù hexokinase, r(HK) = 2 mg/ml, khoảng 280 IU/ml (D-glucose làm cơ chất với sự có mặt của ATP) và glucose-6-phosphat-dehydrogenase r(G6P-DH) = 1 mg/ml, khoảng 140 IU/ml với glucose 6-phosphat làm cơ chất trong dung dịch amoni sulfat, c[(NH₄)₂SO₄] = 3,2 mol/l. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch huyền phù này bền được ít nhất một năm.

Huyền phù enzym PGI

Tạo huyền phù phosphoglucose isomerase, r(PGI) = 2 mg/ml, khoảng 700 IU/ml (với fructose 6-phosphat làm cơ chất) trong dung dịch amoni sulfat, c[(NH₄)₂SO₄] = 3,2 mol/l. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch huyền phù này bền được ít nhất một năm.

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

Pipet dùng cho enzym, chia vạch dọc theo thân, có đầu phân phối dài không chia vạch.

Pipet, có độ chính xác tương đương với 6.1 (có thể dùng thay cho 6.1), ví dụ: pipet mao quản dịch chuyển dương.

Cuvet, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, chiều dài đường quang 10 mm và hấp thụ không đáng kể ở bước sóng 334 nm, 340 nm và 365 nm.

Máy đo phổ vạch, có đèn thủy ngân và bộ lọc để đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Máy đo phổ, (bước sóng có thể thay đổi được) để đo ở bước sóng 340 nm (có thể dùng thay thế 6.4).

Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử

Thông thường các mẫu không cần xử lý trước và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu đã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử.

Trộn kỹ nước quả đục. Pha loãng mẫu thử sao cho nồng độ D-glucose hoặc D-glucose + D-fructose trong khoảng từ 0,1 g/l đến 1,0 g/l. Dung dịch này được dùng để xác định kể cả khi dung dịch có màu đậm.

Qui trình thử nghiệm:

1. Yêu cầu chung

Phép xác định phải được tiến hành ở nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 20 °C đến 25 °C. Sử dụng nhiệt độ không đổi trong dải từ 25 °C đến 37 °C cũng có thể thu được các kết quả tương tự.

NADPH hấp thụ tối đa ở bước sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi thì chỉ đo ở độ hấp thụ tối đa. Khi sử dụng đèn hơi thủy ngân thì sử dụng máy đo dải phổ để đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Không dùng pipet một vạch để lấy các dung dịch. Các dung dịch enzym, coenzym và dung dịch đệm có thể được bổ sung từ pipet tự động thích hợp. Dùng pipet dùng cho enzym hoặc loại tương đương để lấy dung dịch mẫu.

Phép xác định này cũng có thể được tiến hành sử dụng bộ kít thử kết hợp có bán sẵn trên thị trường.

Nếu chất cần được xác định có bán sẵn ở dạng tinh khiết phù hợp, thì nên dùng chất này làm dung dịch chuẩn.

2. Dung dịch mẫu trắng

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm, 0,10 ml dung dịch NADP, 0,10 ml dung dịch ATP, và 2,00 ml nước cho vào cuvet. Trộn đều và sau khoảng 3 min, đọc độ hấp thụ (A₁) của dung dịch so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

3. Dung dịch mẫu thử

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm, 0,10 ml dung dịch NADP, 0,10 ml dung dịch ATP, 0,10 ml mẫu thử và 1,90 ml nước cho vào cuvet. Trộn đều và sau khoảng 3 min, đọc độ hấp thụ (A₁) của dung dịch so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

4. Phản ứng enzym và định lượng

Thực hiện qui trình sau cho từng dung dịch riêng rẽ: Thêm 0,02 ml huyền phù enzym [HK/G6P-DH]. Trộn đều, đợi cho đến khi phản ứng kết thúc (10 min đến 15 min) và đọc độ hấp thụ (A₂) của các dung dịch. Kiểm tra việc kết thúc phản ứng bằng cách cứ 2 min đọc độ hấp thụ A₂ một lần. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 min, thì ngoại suy độ hấp thụ ngược trở lại thời điểm bổ sung huyền phù enzym (HK/G6P-DH).

Sau đó, thêm 0,02 ml huyền phù enzym (PGI). Trộn đều, đợi cho đến khi phản ứng kết thúc (10 min đến 15 min) và đọc độ hấp thụ (A3) của các dung dịch. Kiểm tra việc kết thúc phản ứng bằng cách cứ 2 min đọc độ hấp thụ A₃ một lần. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 min và độ hấp thụ vẫn tăng đều, thì ngoại suy độ hấp thụ ngược trở lại thời điểm bổ sung huyền phù enzym (PGI).

Tính kết quả

Dựa vào các phản ứng, thực hiện phép xác định, có sự tỷ lệ tuyến tính giữa lượng NADPH tạo thành (do chênh lệch độ hấp thụ ΔA) và nồng độ của D-glucose và D-fructose.

ΔA_D-glucose = (A₂ – A₁)_mẫu – (A₂ – A₁)_{mẫu trắng}

ΔA_D-fructose = (A₃ – A₂)_mẫu – (A₃ – A₂)_{mẫu trắng}

Việc tính nồng độ chất trong dung dịch pha loãng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử dựa theo định luật Beer-Lambert.

Hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose, tính bằng gam trên lit mẫu, tính được theo Công thức sau:

Trong đó:

M là khối lượng phân tử glucose hoặc fructose = 180,16 gam trên mol (g/mol);

V₁ là tổng thể tích của dung dịch trong cuvet, tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích của dung dịch mẫu thử bổ sung vào cuvet, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu (xem 7.1);

d là đường quang của cuvet, tính bằng xentimet (cm);

e là hệ số tắt của NADPH;

ở 340 nm = 6,3 ℓ mmol ^-1 cm^-1;

Hg 365 nm = 3,5 ℓ mmol ^-1 cm^-1;

Hg 334 nm = 6,18 ℓ mmol ^-1 cm^-1.

Nếu thể tích đã cho trong dung dịch mẫu trắng và dung dịch mẫu thử không thay đổi thì hàm lượng D-glucose và D-fructose của mẫu, tính bằng gam/lit, tính được theo Công thức sau:

Khi sử dụng bộ kít thử có bán sẵn thì hệ số (5,801 và 5,837) trong các công thức trên có thể khác nhau do tổng thể tích phân tích khác nhau (V₁).

Trong phép tính kết quả, cần tính đến mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu mẫu cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

Báo cáo hàm lượng D-glucose hoặc D-fructose, bằng gam trên lít, đến một chữ số thập phân.

Bài viết tham khảo từ TCVN 10693:2015 (EN 1140:1994).